Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения

* Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. methyticum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O. "Данные по включению 13С приведены для М. flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О.

Исследование степеней включения дейтерия в сопутствующие аминокислоты В. meihylicum на средах с тяжёлой водой. В масс-спектрах всех исследуемых образцов культуральной жидкости Б. melhylicum кроме основной секретируемой аминокислоты (фенилаланин) были обнаружены примеси, метаболически с ней связанных аланина, валина и лейцина/изолейцина

Исследование степеней включения дейтерия в L-Phe В. methylicum в максимально дейтерированной среде. Мы предположили, что за счёт ауксотрофности штамма В. methylicum по лейцину, уровни включения дейтерия в секретируемыи фенилаланин на фоне максимальных концентраций тяжёлой воды могут быть ниже теоретически допустимых вследствие функционирования в клетке ряда биохимических реакций, связанных с ассимиляцией протонированного лейцина извне. Как мы и ожидали, отмеченная особенность лучше всего проявлялась при биосинтезе фенилаланина на дейтерированной среде, в которой единственным протонированным соединением, кроме метанола, являлся лейцин (см. табл. 5, опыт 9). В этом опыте степень дейтерированности L-фенилаланина составила 75%, т.е. только шесть атомов (из восьми в углеродном скелете) в молекуле" фенилаланина биосинтетически замещены на дейтерий. Согласно данным масс-спектрометрического анализа, атомы дейтерия распределены по положениям С1-С6 ароматической части фенилаланина и сопредельному положению , причем, как миниум четыре из них могут быть локализованы в самом бензольном кольце молекулы фенилаланина. Результат по получению L-Phe с данным характером включения метки очень важен для биотехнологического использования и имеет существенные преимущества по-сравнению с химическим (Н-D)-обменом (Griffiths D. V., 1986).

При выделении фракции суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий (В. methylicum, M. flagellatum) учитывалось наличие в них углеводов. Мы использовали богатые по белку штаммы бактерий со сравнительно небольшим содержанием углеводов в них, гидролизу в качестве фракции суммарных белков подвергали остаток после исчерпывающего отделения пигментов и липидов экстракцией органическими растворителями (метанол-хлороформ-ацетон}.

Во всех случаях гидролиз белков проводили в 6 н. растворе DC1 (3 масс.% фенола в D2O) или в 4 н. растворе Ва(ОН):для предотвращения реакций обратного изотопного обмена (H-D) в ароматических аминокислотах и их разрушения.

Дейтерий- и 13С-меченные аминокислоты в составе гидролизатов суммарного белка биомассы были разделены методом ОФ ВЭЖХ со степенью хроматографической чистоты 93-96% и выходами 75-89% в условиях, аналогичных таковым для разделения секретируемых аминокислот (табл. 6). Хотя в таблице 6 приведены данные только для 10 аминокислот, очевидно, что в остальных аминокислотах уровни изотопного включения сопоставимы, хотя они не детектируются данным методом. Это предположение подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методом ионнообменной хроматографии на колонке "Biotronic LC 5001", где детектируется уже 15 аминокислот (см. рис. 4).

Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки белка В. methylicum па средах с тяжёлой водой.

Общие принципы изучения степени изотопного обогащения молекул аминокислот при данном способе введения метки продемонстрированы на примере анализа включения дейтерия в мультикомпонентные смеси аминокислот, полученные после гидролиза суммарных белков биомассы в 6 н. DCl и 4 н. Ва(ОН).

Во всех -экспериментах по научению содержания дейтерия в аминокислотных остатках белка наблюдалась корреляция между степенью изотопного насыщения среды и уровнями включения дейтерия в аминокислоты (табл. 6), Например, для индивидуальных аминокислот белковых гидролизатов количество включенных атомов дейтерия по скелету молекулы варьирует незначительно в пределах 49%-ной концентрации тяжёлой воды и составляет для Ala 45%, Val - 36,3%, Leu/Ile - 42%, Phe -37,5%.

Таблица 6.

Степени включения D и 13С в аминокислотные остатки общих белков биомассы В. melhyiicum* и М. flagellatum**.

'Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. melhyiicum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O. **Данные по включению 13С приведены для М. flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О.

Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки белка В. melhyiicum на максимально дейтерированной среде. Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения дейтерия в аминокислотные остатки белков за счет адаптации культуры В. melhyiicum к росту и биосинтезу на среде с максимальной концентрацией тяжёлой воды. Как видно из таблицы 6, при росте В. methylicum на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды, степени включения дейтерия в остатки Gly, Ala и Phe составляют 90, 97,5 и 95%, т.е. уровень мечения можно считать униформным. Низкие степени включения дейтерия в молекулы лейцина (49%), а также в метаболически связанных аминокислотах в этих условиях могут быть объяснены за счет ауксотрофности штамма в лейцине, который добавляли в среду культивирования в протонированной форме. Полученный результат по разбавлению дейтериевой метки в лейцине может быть объяснён сохранением доли минорных реакций в биосинтезе лейцина de novo.

Исследование степеней включения изотопа углерода I3C в аминокислотные остатки белка М.

flagellation за счёт биоконверсии 13СH3ОН.

В экспериментах по включению изотопа углерода |3С в молекулы белков за счёт биоконверсии 13СH3ОН метилотрофными бактериями М.flagellalum была показана эффективность мечения аминокислот изотопом углерода 13С. Так, в Phe детектировалось 80,5 % метки, в Ala - 95 %, в Gly - 90% (см. табл. 6).

Во всех экспериментах степени включения дейтерия и изотопа углерода 13С в метаболически связанных аминокислотах обнаружили определённую коррелляцию. Так, степени изотопного обогащения валина и лейцина (семейство пирувата), фснилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот} совпадают (табл. 6). Степени изотопного включения глицина и серина (семейство серина), аспарагиповой кислоте и лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Сравнивая данные таблицы 5 и 6, можно заключить, что степени изотопного обогащения экзогенных аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарного белка, в целом, также коррелируют.

Как и в случае с экзогенными аминокислотами, низкие степени включения изотопа углерода 13С в остатки Leu при росте на 1 об.% 13СНзОН обусловлены ауксотрофностью бактерий в этой аминокислоте.

Таким образом, нам удалось достичь максимальных уровней включения стабильных изотопов в суммарные белки биомассы метилотрофных бактерий. Именно поэтому мы посчитали возможным использовать гидролизаты их биомассы для биосинтеза других изотопно - меченных БАС.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГИДРОЛИЗАТОВ БИОМАССЫ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В. methylkum в КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ [1',3',4',2,8-D5]-ИНОЗИНА.

Получение [1',3',4',2,8-D5]- инозина. В следующих экспериментах было апробировано использование дейтеро-компонентов биомассы метилотрофных бактерий, полученных в условиях многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для синтеза высокодейтерированных нуклеозидов (на примере инозина). [1,3',4',2,8-D5]-инозин был получен биосинтетически за счёт использования штамма-продуцента В. subtilis и выделен из культуральной жидкости по методике, включающей адсорбцию инозина на активированном угле, десорбцию спиртово-аммиачным раствором и перекристаллизацию из метанола. ТСХ инозина, с детекцией при 249 нм показала наличие в анализируемом образце единственного пятна с Rf = 0,55, -соответствующего по подвижности чистому инозину.

Особенности разработанного метода получения [1,3',4',2,8-D5]-инозина заключаются в следующих аспектах:

1. В способности высокоактивного штамма В. subtilis к росту и биосинтезу инозина на средах, содержащих максимальные концентрации тяжёлой воды;

2. Замене глюкозы и аминокислот, необходимых для роста этого штамма-ауксотрофа на гидролизаты дейтеро-биомассы В. methylicutn. При последующих ферментациях в качестве источника ростовых факторов можно использовать ту же дсйтеро-биомассу метилотрофных бактерий, либо биомассу самого штамма-продуцента, содержащую в своем составе соединения, которые могут служить источниками углерода и ростовых факторов;

3. В практически полном отсутствии отходов: согласно схеме, дейтеро-биомасса базового штамма, после гидролиза в 6 н. DC1 возвращается в цикл в качестве ростовых факторов;

4. В высокой степени изотопного обогащения дейтерий-мсченного инозина (62,5% атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий);

5. В высоких выходах (3,9 г/л) меченного продукта.

Исследование уровня дейтерированности инозина. Места локализации дейтерия в молекуле инозина, были исследованы с помощью масс-спектрометрии FAB и спектроскопии ПМР (см. схему).

При анализе степени дейтерированности инозина учитывались следующие аспекты. Во-первых, вследствие того, что протоны в C1-C's положениях рибозной части молекулы инозина могли происходить из глюкозы, мы предположили,что характер биосинтетического включения дейтерия в рибозную часть молекулы инозина определяется, в основном, функционированием ряда процессов гексозо-моно-фосфатного (ГМФ) шунта, связанных непосредственно с ассимиляцией глюкозы и других сахаров. Во-вторых, многочисленные обменные процессы и внутримолекулярные перегруппировки, происходящие с участием тяжёлой воды могли также привести к специфическому включению метки по определенным позициям в молекуле инозина. Такими доступными позициями в молекуле инозина признаны, прежде всего, гидроксильные протоны -ОН и протоны при гетероатомах -NH (последние могут обмениваться на дейтерий в тяжёлой воде за счет кето-енольной таутомерии). Три атома дейтерия в рибозном остатке молекулы инозина могли происходить за счет функционирования многочисленных реакций ГМФ-шунта, два атома дейтерия а гипоксантинс также могли синтезироваться de novo (схема).

6. РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ БИОСИНТЕТИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙТЕРИЙ-МЕЧЕНHOI О БАКТЕРИОРОДОПСИНА

Получение дейтерии-меченного бактериородопсина.

В качестве другой модельной системы для введения стабильной изотопной метки в белки, использовали бактериородопсин (bR), синтезируемый в клеточной мембране H. halobium ET 1QOL (рис.6). Для включения дейтериевой метки в bR использовали два принципиально отличных подхода: сайт-специфическое введение отдельных аминокислот: L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp в bR и униформное мечение бактериородопсина дейтерием путем выращивания П. halobium ET 1001 на среде, содержащей 99,9 ат.% тяжёлую воду и дейтеро-гидролизаты В. methylicum.

Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 солюбилизацией в 0,5 %-ном растворе додецилсульфата натрия (ДСН) с последующим осаждением белка метанолом. Гомогенность очищенного bR была потверждена электрофорезом в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1% ДСН.

ОФ ВЭЖХ метиловых эфиров Dns-, и Z-производных аминокислот, полученных после гидролиза bR в 4 н. Ва(ОН)2 или 6 н. DCI (3 масс.% фенола, в тяжёлой воде) показала высокие степени хроматографической чистоты выделенных аминокислот и отсутствие примесей небелковой природы в гидролизатах bR. Согласно данным по разделению дериватизованных гидролизатов bR методом ОФ ВЭЖХ, степени хроматографической чистоты выделенных дейтерий-меченных Dns-Phe-OMe, Dns-Tyr-OMe и Dns-Trp-OMe составили 96, 97 и 98% соответственно.

Исследование степени дейтерироваиности бактериородопсина. Оба подхода показали хорошие результаты по введению дейтериевой метки в молекулу bR. Например, в масс-спектре гидролизата электрофоретически чистого bR, полученного с селективной среды, содержащей L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-2,4,5,6,7-D5]-Trp, после прямой обработки реакционной смеси Dns-Cl и CN2Н2 фиксируются пики, соответствующие молекулярным ионам обогащённых дейтерием Dns-Phe-OMe с М+. при m/z 417 (вместо m/z 412 в контроле), Dns-Tyr-OMe с М+. при m/z 429 (вместо m/z 428) и Dns-Trp-OMe с М+. при m/z 456 {вместо m/z 451).

В случае с униформным мечением bR, метка включалась равномерно по всем положениям углеродного скелета в аминокислотных остатках белка.

ВЫВОДЫ:

1. Подобраны условия для проведения адаптации штаммов R. melhylicum, H.halobium, В. xubiilis и II. amyloliquefaciens к росту на D2О-средах. Селекционно отобраны штаммы, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические характеристики на средах с максимальными концентрациями тяжёлой воды.

2. Показана принципиальная возможность использования суммы химических компонентов дейтеро-биомассы факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum в качестве источников ростовых субстратов для синтеза дейтерий-меченных БАС.

3. Изучено влияние меченных субстратов - D2O, CD3OD и |3СН3ОН на ростовые и биосинтетические параметры различных штаммов -продуцентов БАС. Показано, что униформные уровни включения дейтерия в молекулы синтезируемых БАС можно получить, используя высокодейтерированные среды
(D2О и СНзОН), а в случае с 13С-мечением того же результата можно достигнуть за счёт использования |3СНзОН.

4. Предложена дамсильная модификация препаратов культуральной жидкости для изучения степеней изотопного обогащения аминокислот методом масс-спектрометрии электронного удара. Метод позволяет проводить анализ изотопного состава мультикомпонентных смесей аминокислот, как свободных
аминокислот из культуральной жидкости, так и аминокислот в составе гидролизатов суммарных белков биомассы.

Проведено сравнительное изучение степеней включения дейтерия и изотопа углерода 13С в молекулы экзогенных аминокислот, так и в аминокислотные остатки суммарных белков штаммов метилотрофных бактерий в условиях их роста на средах, содержащих ступенчато увеличивающие концентрации тяжёлой воды.

Определена чёткая корреляция между уровнем включения изотопной метки в молекулы аминокислот и концентрации тяжёлой воды в ростовых средах.

Разработана схема получения дейтерий-меченных БАС с высокими степенями изотопного обогащения, основанная на использовании гетеротрофных микроорганизмов - продуцентов соответствующих БАС. Данная схема проверена на примере получения дейтерий-меченных инозина и бактериородопсина.

Исследованы методы сайт-специфического и униформного введения дейтериевой метки в бактериородопсин. Показано, что включение отдельных дейтерий-меченных аминокислот в молекулу бактериородопсина носит селективный характер, а использование адаптированного к D2O Н. halobium ET 1001 на средах с меченными субстратами и 99,9% D2O позволяет получать униформно меченный бактериородопсин.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ.

Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. Биосинтетическое получение дсйтерий-мсченного L-фенилалаиина, секрстируемого метилотрофным мутантом Brevibaclerium methylicum II Биотехнология. 1993. №9. С. 16-20,

Егорова Т. А., Мосин О. В., Еремин С. В-, Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Препаративное разделение аминокислот белковых гидролизатов в виде бензилоксикарбонильных производных // Биотехнология. 1993. № 8. С. 21-25.

Беккер Г. Д., Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н. Аминокислоты, меченные стабильными изотопами: получение и масс-спектро метрически и контроль. (Тезисы докл. 4-й Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии")- Екатеринбург. 20-22 апрель 1994. С. 127-128.

Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н., Складнев Д. А., Акимова О. Л., Цыганков Д, Ю. Штамм Brevibacterium methylicum - продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.

5. Казаринова Л. А., Королькова Н. В., Миронов А. С., Мосин О. В.. Складнев Д. А., Юркевич А. М. Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов. Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.

6. Karnaukhova Е. N. Mosin О. V.. and Reshetova О. S. Biosynthetic production of stable isotope labeled ammo acids using methylotroph Methylobacillus JlageUattan // Ammo Acids. 1993. V. 5. № 1. P. 125.

7. Mogin O. V.. Karnaukhova E. N., Pshenichnikova А. В., Reshetova O. S. Electron impact spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin. 6th International Conference on Retinal Proteins. 19-24 June 1994. Leiden. The
Netherlands. P. 115.

8. Mosin O. V,. Karnaukhova E. N., Skladnev D. A. Application of methylotrophic bacteria for preparation of stable isotope labeled amino acids. 7th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms. 26 June 1994. Quebec. Canada. P. 163.

9. Matveev A. V., Mosin_O. V.. Skladnev D. A., Yurkevich A. M., and Shvcts V. Melhylolrophic adaptation to highly deuterated substrates. 8th International Symposium on Microbial Growth on Ci-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 49.

10. Mosin O. V.. Karnaukhova E. N., Skladnev D. A., and Shvets V. I. Preparation of D-and L'C-amino acids via bioconvertion of Ci-substrates, 8lh International Symposium on Microbial Growth on Сi-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 80.

Shvets V. I., Yurkevich A. M., Mosin_O. V.. Skladnev D. A. Preparation of deuterated inosine suitable for biornedical application // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V. 8. № 4. P. 231-232.

Мосин О. В.. Складнее Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. II Биотехнология. № 3. 1996. С. 32-37.

Мосин О. В.. Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Получение бантериородопсина, меченного по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана // Биотехнология. № 3. 1996. С. 14-20.

Мосин _О.В. Казаринова Л. А., Преображенская Е. С., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейтерированной среде. // Биотехнология. № 4. 1996.

Страницы: 1, 2, 3, 4