Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения
Адаптация облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum. В связи с важностью препаративного аспекта получения дейтерий-меченных соединений в рамках данной работы была изучена возможность адаптации различных штаммов-продуцентов БАС к росту на средах с максимальными концентрациями тяжелой воды (D2O). Для этого были проверены представители различных таксономических групп метилотрофных бактерий, имеющихся в коллекции ГосНИИ Генетики: L-лейцин-продуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum (ileu), реализующий 2-кего-3-дезокси-6-фосфогдюконат-альдолазный (КДФГ) вариант рибулё'зо-5- монофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции углерода и L-фенилаланин-продуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum (leu), ассимилирующий метанол по РМФ- циклу.
Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации тяжёлой воды в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к тяжёлой воде будет оказывать благоприятный эффект на скорость роста культуры. При этом штамм М. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде: ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях D2О в среде 74,5 об.%. Роста бактерий на более высокой концентрации тяжёлой воды достичь не удалось. В связи с этим, в экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовали препараты культуральной жидкости и биомассы М. flagellatum, полученные со среды, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Концентрация экзогенного дейтерометанола CD3OD составляла, как обычно, 1 об.%.
Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum. Попытки адаптировать штамм В. methylicum к росту при сохранении способности к биосинтезу L-фенилаланина на максимально дейтерированной среде привели к желаемому результату. К данному штамму метилотрофных бактерий был применён специально разработанный нами подход по адаптации, который заключался в серии из пяти адаптационных пассажей исходной культуры на агаризованных средах (с добавкой 2 об. % дейтерометанолом CD3OD) при ступенчатом увеличении концентраций экзогенной тяжёлой воды (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 об% до 98 об% D2O) и последующей селекции устойчивых к тяжёлой воде клонов бактерий. При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих тяжёлую воду. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированпости, включая среду с 98 об.% тяжёлой водой (степень выживаемости бактерий на конечной полностью дейтерированной среде составляет не более 40%).
Полученный результат в опытах по адаптации В. methylicum к тяжёлой воде, позволил использовать гидролизаты его биомассы, а также саму биомассу, полученную в ходе многоступенчатой адаптации к D2O в качестве полноценных ростовых субстратов для выращивания бациллярных штаммов В. subtillis и В. amytoliquefaciens, а также штамма галофильных бактерий Н. halobium ET1001.
Адаптация бацилл В. subtittis и В. amyloliqucfaciens. В следующих опытах была исследована способность к росту на тяжёлой воде бациллярных штаммов В. subtillis (his, tyr, ade, иrа), и В. amyloliquefaciens (ade, иrа), продуцентов инозина и тимидина, соответственно. Мы предположили, что замедление роста бактерий на минимальных средах, содержащих тяжёлую воду могло быть обусловлено появлением ауксотрофности по отдельным ростовым факторам. Чтобы проверить это предположение, в дальнейшем мы использовали комплексные среды. Как и предполагалось, обе культуры удалось адаптировать к дейтерию путём рассева на твёрдые среды, приготовленные из 99,9 ат.% тяжёлой воды. Они сразу обнаружили нормальный рост на тяжёлой воде. У штаммов В. subtilis и В. amyloliquefaciens при росте на тяжёлой воде было отмечено сохранение высокого уровня продукции по инозину и тимидину (3,9 и 3,0 г/л соответственно).
Адаптация галофильных бактерий Н. halobium ET 1001. В случае с Н. halobium ET 1001 адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99,9 ат.% тяжёлую воду путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой среде с тяжёлой водой. В обычных для этой бактерии условиях культивирования (37°С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного бактериородопсина.
2. ИЗУЧЕНИЕ РОСТА И БИОСИНТЕЗА БАС ПОЛУЧЕННЫМИ ШТАММАМИ
Изучение ростовых характеристик М. jlagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O, а также 13СНзОН. Данные по росту штамма М. Jlagellatum на минимальных средах с добавкой 1 об.% метанола СНзОН и его меченных аналогов (СDзOD/13СНзОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице I. Как видно из таблицы I, на средах, содержащих тяжёлую воду и изотопные аналоги метанола - дейтеро-метанол CD3OD и 13С-метанол 13CH3OH, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% тяжёлой водой выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол СНзОН (табл. 1, опыты 1,3,8). Как видно, способность к росту у М. flagellatum сохранялась лишь в среде, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование скорости роста бактерий.
Таблица 1. Влияние изотопного состава среды на рост штамма M.flagelaum.
Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время опыта лаг-фазы биомассы генерации Н2О D2O СНзОН СDзОD часы % ч
|
|
1
|
99,0
|
0
|
1,0
|
0
|
0
|
100
|
1,1
|
|
2
|
99,0
|
0
|
0,5
|
0,5
|
0,2
|
91,0
|
0,8
|
|
3
|
99,0
|
0
|
0
|
1,0
|
0,8
|
81,0
|
1,0
|
|
4
|
49,5
|
49,5
|
1,0
|
0
|
2,4
|
76,0
|
1,4
|
|
5
|
49,5
|
49,5
|
0,5
|
0,5
|
5,7
|
75,0
|
1,2
|
|
6
|
49,5
|
49,5
|
0
|
1,0
|
6,7
|
70,0
|
1,3
|
|
7
|
24,5
|
74,5
|
1,0
|
0
|
5,6
|
29,0
|
1,4
|
|
8
|
99,0
|
0
|
1,0 'ЗСНзОН
|
0
|
0,1
|
72,0
|
1,0
|
|
|
Как и следует из литературных данных (Складнее Д. А, 1990), введение стабильного изотопа углерода |3С не приводит к летальным последствиям для клетки, что мы и наблюдали в случае с М. flage/talum. В целом, полученные для М. flagellatum данные могут свидетельствовать о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями их метаболизма. Кроме этого, из таблицы 1 следует, что данный подход можно эффективно использовать для введения в синтезируемые БАС двойной изотопной метки (дейтерий- и изотоп углерода 15C).
Изучение ростовых и биосинтетических характеристик Б. methylicum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O. Данные по росту исходного и адаптированного к тяжёлой воде штамма В. methylicum и максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% метанола и его дейтерированного аналога СН3OН/CD3OD, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды, представлены в таблице 2. Как видно из табл. 2, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. табл. 2, опыт 1). С увеличением концентрации тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% тяжелой водой и 2 об.% CD3OD (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде (табл. 2, опыт 10).
Таблица 2.
Влияние изотопного состава среды на рост штамма В. mehylicum и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости*.
Номер Компоненты среды, об% лаг-фаза Выход Время Выход опыта биомассы генер. L-Phe, Н2 О D2O СH3ОН CD3OD ч % ч %
|
|
1
|
98
|
0
|
2
|
0
|
24,0
|
100
|
2,2
|
100
|
|
2
|
98
|
0
|
0
|
2
|
30,3
|
92,3
|
2,4
|
99,1
|
|
3
|
73,5
|
24,5
|
2
|
0
|
32,1
|
90,6
|
2,4
|
96,3
|
|
4
|
73,5
|
24,5
|
0
|
2
|
34,7
|
85,9
|
2,6
|
97,1
|
|
5
|
49,0
|
49,0
|
2
|
0
|
40,5
|
70,1
|
3,0
|
98,0
|
|
6
|
49,0
|
49,0
|
0
|
2
|
44,2
|
60,5
|
3,2
|
98,8
|
|
7
|
24,5
|
73,5
|
2
|
0
|
45,8
|
56,4
|
3,5
|
90,4
|
|
8
|
24,5
|
73,5
|
0
|
2
|
49,0
|
47,2
|
3,8
|
87,6
|
|
9
|
0
|
98,0
|
2
|
0
|
60,5
|
32,9
|
4,4
|
79,5
|
|
10
|
0
|
98,0
|
0
|
2
|
64,4
|
30,1
|
4,9
|
71,5
|
|
10'
|
0
|
98,0
|
0
|
2
|
39,9
|
87,2
|
2,9
|
95,0
|
|
|
'Данные (1-10) приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.
Данные 10' приведены для адаптированного В. methylicum.
Как видно из табл. 2, опыт 2, дейтерометанол CD3OD не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выход микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% тяжёлой водой микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды и 2 об.% дейтерометанола СDзОD, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза no-сравнению с контролем. Важно то, что выход микробной биомассы и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к тяжёлой воде штамма В. inethylicum в полностью дейтерированной среде изменяются по сравнению с контрольными условиями на 12,8% и 5% соответственно (табл. 2, опыт 10').
Страницы: 1, 2, 3, 4
|
|